Trịnh Thị Huy Trà1, Nguyễn Bá Nam1, Lương Văn Dũng1, Lê Ngọc Triệu1, Trần Hiếu2*
1Trường Đại học Đà Lạt, Việt Nam
2Trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Phân hiệu Ninh Thuận, Việt Nam
TÓM TẮT
Trà Mã Dọ (Camellia sinensis var. madoensis) là 1 loài chè đặc hữu hẹp ở Việt Nam, mọc tự nhiên và phân bố trên các đỉnh núi cao giáp ranh giữa Phú Yên và Bình Định. Trong nghiên cứu này, phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology - RSM) được ứng dụng để thiết kế các thí nghiệm tạo rễ Trà Mã Dọ. Kết quả thu được từ thực nghiệm và mô hình dự đoán: Tạo rễ in vitro tối ưu là môi trường WPM khi bổ sung 1,5 mg/L IBA và 1,0 mg/L NAA. Nghiên cứu cung cấp những thông tin mới về phương pháp thiết kế tối ưu hóa chất điều hoà sinh trưởng cho quá trình tạo rễ in vitro dựa trên mô hình D - optimal.
Từ khoá: Camellia sinensis var. Madoensis, in vitro, RSM, Trà Mã Dọ, tạo rễ.
MỞ ĐẦU
Trà Mã Dọ (Camellia sinensis var. madoensis) là thực vật thân gỗ thuộc họ chè (Theaceae), là loài đặc hữu hẹp ở Việt Nam, mọc tự nhiên và phân bố tập trung trên các núi cao từ 500 - 700 m, giáp ranh giữa Phú Yên và Bình Ðịnh (Vũ et al., 2021), vốn là loại cây mọc tự nhiên, có giá trị kinh tế cao nên Trà Mã Dọ bị khai thác gần như cạn kiệt trong khi tái sinh ngoài tự nhiên kém. Trong thực tế sản xuất, các giống chè khi mới được phát hiện hoặc lai tạo với số lượng cá thể ban đầu ít và có những đặc điểm ưu tú sẽ được nhân giống vô tính. Tuy nhiên, để mở rộng quy mô canh tác với mật độ tiêu chuẩn 11.000 – 15.000 cây/ha thì cần rất nhiều thời gian. Tối ưu hoá quy trình vi nhân giống các loại cây trồng là quá trình phức tạp do ảnh hưởng và tương tác bởi nhiều yếu tố khác nhau (Jafari et al., 2022). Phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology - RSM) được Box và Willson khởi sướng vào năm 1951 là một phương pháp thống kê dựa vào các thuật toán để xác định sự ảnh hưởng và tối ưu các yếu tố giúp tiết kiệm thời gian nghiên cứu (Gangil, Pradhan, 2017). Nhận thấy ưu điểm vượt trội của phương pháp RSM trong thiết kế tối ưu hóa và tiềm năng ứng dụng trong nhân giống thực vật. Nghiên cứu ứng dụng phương pháp bề mặt đáp ứng trong ra rễ in vitro Trà Mã Dọ được thực hiện góp phần bảo tồn, mở rộng diện tích vùng trồng và giảm áp lực khai thác trong tự nhiên đối với loại cây này.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu nuôi cấy
Chồi Trà Mã Dọ thu hái tại thị xã Sông Cầu, Phú Yên. Chồi khoẻ mạnh, không sâu bệnh được rửa sạch dưới vòi nước chảy, tiến hành khử trùng bằng HgCl2 0,01% trong 10 phút, rửa lại nhiều lần bằng nước hấp vô trùng, chồi được cấy trên môi trường MS (Murashige, Skoog, 1962) bổ sung 0,3 mg/L BA để bật chồi và cấy chuyền cũng trên môi trường này nhằm tạo đủ số lượng chồi cho thí nghiệm. Vật liệu cho giai đoạn tạo rễ là các đoạn chồi ngọn in vitro cao 2 cm.
Phương pháp nghiên cứu
Thiết kế thí nghiệm
Phạm vi khảo sát chất điều hòa sinh trưởng gồm IBA: 0 - 3 mg/L; NAA: 0 - 1 mg/L được thực nghiệm trên môi trường WPM (Lloyd, McCown, 1980) và dưới sự điều chỉnh kết hợp từ chương trình thử nghiệm DOE (Design of experiments) bằng phần mềm Design - Expert. V12 (Stat-Ease Inc., Minneapolis, MN, USA), dựa trên mô hình D – optimal (Bảng 1). Ngoài ra, môi trường nuôi cấy được bổ sung thêm 8,5 g/L Agar, 0,3 g/L than hoạt tính và 30 g/L sucrose, pH = 5,8. Mẫu cấy được nuôi với nhiệt độ trung bình là 25 ± 2oC, độ ẩm trung bình là 55 - 60%, đặt dưới ánh sáng đèn huỳnh quang với quang chu kì là 16 giờ/ngày và cường độ chiếu sáng 40 - 45 µmol.m-2.s-1. Sau 12 tuần nuôi cấy, các chỉ tiêu sinh trưởng được ghi nhận.
Bảng 1. Ma trận thí nghiệm tạo rễ in vitro gồm 2 yếu tố chất điều hòa sinh trưởng (IBA, NAA)
|
Nghiệm thức (NT)
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
9
|
|
IBA (mg/L)
|
0,0
|
0,4
|
0,4
|
1,5
|
1,5
|
1,5
|
2,6
|
2,6
|
3,0
|
|
NAA (mg/L)
|
0,5
|
0,1
|
0,9
|
0,0
|
0,5
|
1,0
|
0,1
|
0,9
|
0,5
|
Xử lý số liệu
Các thí nghiệm được thực nghiệm theo thiết kế ở bảng 1 với 9 nghiệm thức (3 bình/nghiệm thức, 3 chồi/bình) và mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Số liệu thu nhận được xử lý trung bình bằng MicroSoft Excel 2019 và các phương pháp thống kê sinh học theo Duncan’ test (P < 0,05) sử dụng phần mềm SPSS V.25.0.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Kết quả ra rễ in vitro Trà Mã Dọ
Sau 20 ngày, rễ đầu tiên được ghi nhận ở nghiệm thức kết hợp 0,4 mg/l IBA với 0,9 mg/l NAA và nghiệm thức kết hợp 1,5 mg/l IBA với 1,0 mg/l NAA. Nghiệm thức (1,5 mg/l IBA + 1,0 mg/l NAA) cho số lượng rễ (6,0 rễ/cây) và hình thái rễ tốt hơn so với nồng độ khác, tỷ lệ ra rễ đạt 80%, rễ dài 11,01 mm. Rễ màu trắng, mập, khỏe mạnh, có rễ thứ cấp phát triển. Mẫu cây cao, mập, lá dày, mở tròn, rõ răng cưa, màu xanh đậm (Hình 1). Hơn nữa, trên công thức môi trường này có sự hình thành mô sẹo nhưng mô sẹo với kích thước nhỏ nên không gây ảnh hưởng đáng kể đến sức sống cây con.
Bảng 2. Ảnh hưởng của nồng độ IBA và NAA lên khả năng ra rễ Trà Mã Dọ trên nền môi trường WPM
|
IBA
|
NAA
|
Ngày ra rễ
|
Số rễ/cây
|
Chiều dài rễ (mm)
|
Số lá
|
Chiều cao cây (cm)
|
% Rễ
|
% Tạo mô sẹo
|
Hình thái mẫu cấy
|
|
0,0
|
0,5
|
25,00b*
|
1,40b
|
4,00ab
|
10,40a
|
3,58a
|
40ab
|
40a
|
Rễ mảnh, xanh, sẹo trắng, cứng
|
|
0,4
|
0,1
|
33,00d
|
1,60b
|
3,93ab
|
9,20ab
|
3,09ab
|
40ab
|
32b
|
Rễ mảnh, trắng, sẹo cứng, có rễ thứ cấp
|
|
0,4
|
0,9
|
20,00a
|
1,20b
|
3,06ab
|
8,00ab
|
3,18ab
|
40ab
|
43a
|
Rễ mảnh, trắng, sẹo trắng, cứng
|
|
1,5
|
0,0
|
-
|
-
|
-
|
8,40ab
|
3,19ab
|
-
|
27c
|
Chồi thẳng, mập, lá mở, xanh đậm
|
|
1,5
|
0,5
|
21,40a
|
2,08b
|
7,45ab
|
8,52ab
|
3,20ab
|
52ab
|
42a
|
Rễ mập, xanh, sẹo trắng, cứng
|
|
1,5
|
1,0
|
20,00a
|
6,00a
|
11,01a
|
9,80b
|
3,63a
|
80a
|
43a
|
Rễ mập, có rễ thứ cấp, sẹo nhỏ, cứng
|
|
2,6
|
0,1
|
80,00e
|
0,40b
|
0,41b
|
8,20ab
|
3,21ab
|
40ab
|
32b
|
Rễ ngắn, trắng, sẹo nhỏ, trắng, cứng
|
|
2,6
|
0,9
|
27,00c
|
0,80b
|
2,74ab
|
9,20ab
|
2,95b
|
40ab
|
43a
|
Rễ mảnh, xanh, sẹo trắng, cứng
|
|
3,0
|
0,5
|
25,00b
|
2,60b
|
4,65ab
|
6,80b
|
2,954b
|
60ab
|
45a
|
Rễ mảnh, xanh, sẹo trắng, cứng
|
Chú thích: *: Những chữ cái khác nhau trên cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p < 0,05 theo phép thử Duncan.
IBA và NAA đã được sử dụng để thúc đẩy sự tạo rễ ở một số loài chè, với 5,0 mg/l IBA và 0,5 mg/l NAA, loài Camellia piquetiana (Pierre) Sealy đạt tỷ lệ ra rễ 100% với 14 rễ/chồi (Kết et al., 2014). Thí nghiệm bổ sung đồng thời IBA và NAA được ghi nhận cho hiệu quả ra rễ cao hơn so với bổ sung auxin riêng lẻ ở chè Camellia tamdaoensis (Hường, Việt, 2017). Dữ liệu thu được về khả năng tạo rễ Trà in vitro cho thấy nền môi trường WPM là tốt nhất. Số rễ/cây đạt được cao nhất là 6,00 rễ ở các nồng độ tối ưu được là IBA 1,5 mg/L và NAA 1,0 mg/L.
Hình 1. Ảnh hưởng của tổ hợp IBA và NAA đến sự tạo rễ Trà Mã Dọ trên môi trường WPM. A. 0,0 mg/l IBA + 0,5 mg/l NAA; B. 0,4 mg/l IBA + 0,1 mg/l NAA; C. 0,4 mg/l IBA + 0,9 mg/l NAA; D. 1,5 mg/l IBA + 0,0 mg/l NAA; E. 1,5 mg/l IBA + 0,5 mg/l NAA; F. 1,5 mg/l IBA + 1,0 mg/l NAA; G. 2,6 mg/l IBA + 0,1 mg/l NAA; H. 2,6 mg/l IBA + 0,9 mg/l NAA; I. 3,0 mg/l IBA + 0,5 mg/l NAA. Bar: 1 cm.
So sánh mô hình thiết kế thí nghiệm lý thuyết và thực nghiệm
Dựa trên kết quả phân tích ANOVA, trong số tác động của các yếu tố khảo sát, tác động NAA đến tỷ lệ hình thành mô sẹo cho các giá trị có ảnh hưởng và với mức ý nghĩa P < 0,05 (Bảng 3); trong khi đó, các tác động của IBA và NAA đến các chỉ tiêu khác có ảnh hưởng thấp, đồng thời giá trị P > 0,05 nên không có ý nghĩa về mặt thống kê, do đó bị loại bỏ (kết quả không thể hiện).
Thiết kế RSM (D- Optimal) nhằm xây dựng mô hình bậc cao mô tả mối quan hệ giữa tỷ lệ tạo sẹo (%) với các yếu tố đầu vào là: IBA, NAA. Thí nghiệm gồm 9 nghiệm thức, kết quả phân tích hàm mục tiêu được biểu diễn bằng phương trình bậc hai: Y(tỷ lệ tạo mô sẹo) thực nghiệm = 26,58 + 0,42 IBA + 43,65 NAA - 0.000 IBA*NAA + 0,13 IBA2 - 28,91 NAA2. Qua phân tích ANOVA cho thấy, sự ý nghĩa của các hệ số hồi quy được kiểm tra bởi các chuẩn F - value, với các giá trị P-value < 0,05 cho biết các hệ số hồi quy có ý nghĩa. Trong bảng 3 cho thấy, giá trị “Model - F- value” là 24,37 và mô hình hoàn toàn có ý nghĩa thống kê với mức (P -value = 0,0124). Từ dữ kiện thực nghiệm các mối tương quan là R2 = 0,9760; R2 adj = 0,9359; R2 Predic (độ chính xác phù hợp Adeq Precision) = 12,6562 lớn hơn nhiều so với 4. Theo Zabeti và đồng tác giả (2009) thông số Adeq Precision lớn hơn 4 là cần thiết để sử dụng dự đoán mô hình; như vậy độ phù hợp (significant) của mô hình này khá cao (Bảng 4, 5; Hình 2).
Bảng 3. Phân tích ANOVA tối ưu quá trình tổng hợp yếu tố chất điều hoà đến khả năng hình thành mô sẹo
|
Nguồn
|
Tổng bình phương
|
Hệ số tự do
|
Trung bình bình phương
|
F-value
|
P-value
|
Sự phù hợp của mô hình
|
|
Mô hình
|
326,19
|
5
|
65,24
|
24,37
|
0,0124
|
Phù hợp (significant)
|
|
A-IBA
|
0,0660
|
1
|
0,0660
|
0,0247
|
0,8852
|
Không chấp nhận
|
|
B-NAA
|
88,61
|
1
|
88,61
|
33,10
|
0,0104
|
Chấp nhận
|
|
AB
|
0,0000
|
1
|
0,0000
|
0,0000
|
1,0000
|
Không chấp nhận
|
|
A2
|
0,0738
|
1
|
0,0738
|
0,0276
|
0,8787
|
Không chấp nhận
|
|
B2
|
47,18
|
1
|
47,18
|
17,62
|
0,0247
|
Chấp nhận
|
|
Sai số (Residual )
|
8,03
|
3
|
2,68
|
|
|
|
|
Tổng tương quan
|
334,22
|
8
|
|
|
|
|
Bảng 4. Kết quả phân tích sự phù hợp của mô hình với thực nghiệm
|
Thông số
|
Giá trị
|
Thông số
|
Giá trị
|
|
Độ lệch chuẩn
|
1,64
|
Hệ số tương quan R2
|
0,9760
|
|
Giá trị trung bình
|
38,56
|
Hệ số tương quan hiệu chỉnh R2 adj
|
0,9359
|
|
Hệ số biến thiên %
|
4,24
|
Hệ số tương quan dự đoán R2 Predic
|
0,8019
|
|
Tổng bình phương phần dư dự đoán (PRESS)
|
66,22
|
Độ chính xác phù hợp (Adeq Precision)
|
12,6562
|
Bảng 5. Kết quả kiểm tra thực nghiệm và các thông số tối ưu từ phương trình hồi quy.
|
Nồng độ chất điều hoà sinh trưởng
|
IBA (mg/L)
|
0,0
|
0,4
|
0,4
|
1,5
|
1,5
|
1,5
|
2,6
|
2,6
|
3,0
|
|
NAA (mg/L)
|
0,5
|
0,1
|
0,9
|
0,0
|
0,5
|
1,0
|
0,1
|
0,9
|
0,5
|
|
Tỷ lệ tạo mô sẹo (%)
|
Thực nghiệm
|
40
|
32
|
43
|
27
|
42
|
43
|
32
|
43
|
45
|
|
Dự đoán
|
41
|
30
|
43
|
27
|
42
|
42
|
33
|
44
|
44
|
Trong vi nhân giống, RSM đã được nghiên cứu trên một số đối tượng cây trồng khác nhau như: Nghiên cứu tối ưu hóa thành phần môi trường trên các giống Mâm xôi đỏ (Poothong, Reed, 2016); sử dụng hồi quy tuyến tính trong phân tích các thành phần vi lượng trong nuôi cấy cây Dâu tây (Akin et al., 2020); xây dựng mô hình dinh dưỡng khoáng lên nuôi cấy chồi cây Mơ (Kovalchuk et al., 2017). Nhìn chung, việc sử dụng phương pháp RSM trong tối ưu hóa các yếu tố là một công cụ hữu hiệu để hợp lý hóa và nâng cao hiệu quả trong nghiên cứu. Ở Việt Nam, RSM chưa thực sự được quan tâm trong lĩnh vực vi nhân giống. Kết quả nghiên cứu này về ứng dụng phương pháp RSM trong ra rễ Trà Mã Dọ, mặc dù mô hình đáp ứng chỉ phù hợp trong dự đoán tỷ lệ hình thành mô sẹo nhưng là tiền đề mở ra hướng nghiên cứu cho đối tượng này và xa hơn là trên nhiều đối tượng cây trồng khác.
Hình 2. Bề mặt đáp ứng IBA và NAA đến đến tỷ lệ mô sẹo cây Trà Mã Dọ.
KẾT LUẬN
Trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu đã sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng để điều chỉnh nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trên môi trường WPM, nhằm tối ưu hóa khả năng tạo rễ Trà Mã Dọ in vitro theo mô hình D-optimal. Dựa vào thực nghiệm và kết quả dự đoán từ mô hình đã xác định được môi trường tốt nhất là môi trường WPM bổ sung 1,5 mg/L IBA và 1,0 mg/L NAA. RSM là cách tiếp cận phù hợp hơn so với phương pháp thí nghiệm truyền thống, giúp tiết kiện thời gian và thu hẹp không gian tìm kiếm các điểm tối ưu.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Akin, M., Eyduran, S. P., Eyduran, E., & Reed, B. M. (2020). Analysis of macro nutrient related growth responses using multivariate adaptive regression splines. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 140(3), 661-670.
Gangil, M., & Pradhan, M. K. (2017). Modeling and optimization of electrical discharge machining process using RSM: A review. Materials Today: Proceedings, 4(2), 1752 -1761.
Hường. N. T., & Việt. N. V. (2017). Nhân giống cây Trà hoa vàng Tam Đảo (Camellia tamdaoensis Ninh et Hakoda) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro. Tạp chí Khoa học và Công nghệ Lâm nghiệp, 4, 17–22.
Jafari, M., Daneshvar, M. H., Jafari, S., & Hesami, M. (2022). Machine learning-assisted in vitro rooting optimization in Passiflora caerulea. Forests, 13(12), 2020.
Kết. N. V., Cúc. N. T., & Thành. N. T. (2014). Khảo sát khả năng nhân giống cây Trà my hoa đỏ (Camellia piquetiana (Pierre) Sealy) in vitro. Tạp chí Khoa học Đại học Quốc gia Hà Nội: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 30(3), 17–25.
Kovalchuk, I. Y., Mukhitdinova, Z., Turdiyev, T., Madiyeva, G., Akin, M., Eyduran, E., & Reed, B. M. (2017). Modeling some mineral nutrient requirements for micropropagated wild apricot shoot cultures. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 129(2), 325-335.
Lloyd, G. B., & McCown, B. H., (1980). Commercially-feasible micropropagation of mountain laurel, Kalmia latifolia, by use of shoot-tip culture. Proceeding of the International Plant Propagation Society, 30, 421-427.
Murashige, T., & Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia plantarum, 15(3), 473–497.
Poothong, S., & Reed, B. M. (2016). Optimizing shoot culture media for Rubus germplasm: the effects of NH4+, NO3−, and total nitrogen. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant, 52(3), 265-275.
Vũ, N. T., Nhu, V. T. N., Quang, T. T., Tran, P. T. T., Nam, N. B., Trâm, L. T. N., Thùy, T. H., Banh, V., Thịnh, T. T., Thu, N. V., & Thương, T. H. (2021). Điều tra khu phân bố đặc điểm hình thái Trà Mã Dọ trên địa bàn thị xã Sông Cầu. Tạp chí khoa học và công nghệ Phú yên, 2,16-18.
Zabeti, M., Daud, W. M. A. W., & Aroua, M. K. (2009). Optimization of the activity of CaO/Al2O3 catalyst for biodiesel production using response surface methodology. Applied Catalysis A: General, 366(1), 154-159.
OPTIMIZATION OF GROWTH REGULATORS FOR IN VITRO ROOT INDUCTION IN CAMELLIA SINENSIS VAR. MADOENSIS WITH THE AID OF A RESPONSE SURFACE EXPERIMENTAL DESIGN
Trinh Thi Huy Tra1, Nguyen Ba Nam1, Lương Van Dung1, Le Ngoc Trieu1, Tran Hieu2*
1 Da Lat University, Vietnam
2 Nong Lam University Ho Chi Minh City – Campus in Ninh Thuan, Vietnam
SUMMARY
Ma Do tea (Camellia sinensis var. madoensis) is an endemic species of tea in Vietnam, naturally growing primarily on high mountain peaks along the borders of Phu Yen and Binh Dinh. In this study, the Response Surface Method (RSM) was employed to design experiments for micropropagation of Ma Do tea. The results obtained from these experiments and predictive models indicate that an optimal medium for root is WPM supplemented with 1.5 mg/L IBA and 1.0 mg/L NAA. Study offers new information on optimized design methods in the field of woody plant micropropagation, thus creating favorable conditions for the propagation of rare tea varieties.
Keywords: Camellia sinensis var. madoensis, in vitro, root induction, Ma Do tea, RSM.
* Author for correspondence: Tel: +84-984940341; Email: hieu.tran@hcmuaf.edu.vn